Звіт про трансдермальну проникність крему Revalife, що містить глюкозамін
  • RU
  • UA

КРЕМ REVALIFE™ – ЗНІМАЄ БІЛЬ У СУГЛОБАХ І ПОДОВЖУЄ ЇМ ЖИТТЯ

Звіт про трансдермальну проникність крему Revalife, що містить глюкозамін

Автори: Solomon T. Garner, JR., M.S., Phd. (solgar@aol.com).

Перспективи застосування глюкозаміну

В Європі глюкозамін використовували протягом більше тридцяти років, починаючи з 1970-х років минулого століття, як терапевтичний препарат для лікування при остеоартриті [1, 2]. Таким чином, глюкозаміну сульфат схвалений в якості лікарського засобу, що відпускається за рецептом, в деяких європейських країнах [3]. Експерименти in vitro показали, що введення глюкозаміну сульфату в людські хондроцити в тканинній культурі призводить до його включення до складу глікозаміногліканів (ГАГ), а також до активації синтезу ядерного білка, що сприяє продукції протеоглікана [4, 5].

Глюкозамін, що утворюється в організмі у вигляді глюкозаміну 6-фосфату, є основним будівельним блоком, необхідним для біосинтезу таких з’єднань, як гліколіпіди, ліпопротеїни, ГАГ, гіалуронат і протеоглікани (рис. 1). Глюкозамін є нормальною складовою хрящової матриці і синовіальної рідини [6]. Глюкозаміна 6-фосфат потрібен для утворення галактозаміну, N-ацетилглюкозамін і хондроітінсульфата. Кератансульфатів і гілуронати грають центральну роль в збірці хрящових матриць і необхідні для підтримки структурної та функціональної цілісності суглобового хряща. Глюкозаміна 6-фосфат потрібні також для синтезу гіалуронової кислоти, основи протеогліканів [7]. Даних про токсичність глюкозаміну при високих дозах немає. Екскреція в основному здійснюється через сечу і фекалії, причому з організму виводиться 87% введеного перорально глюкозаміну [8]. Основна гіпотеза про дію глюкозаміну полягає в тому, що він дозволяє обійти обмежуючий швидкість метаболічний блок при конверсії глюкози в глюкозамін і стимулює біосинтез ГАГ і гіалуронової кислоти, необхідної для утворення протеогліканів, виявлених в структурній матриці [5, 7].

Хоча терапевтична користь глюкозаміну і його аналогів вивчені недостатньо [9], можуть використовуватися протизапальні властивості екзогенного глюкозаміну в зменшенні ступеня набрякання і болю у суглобах, можна порівняти з такими для НПЗП [10-12]. Виявлено, що при дегенерації хряща такі прозапальні цитокіни, як IL-1β і TNFα, пов’язані з підвищеною деградацією хрящової матриці [13, 14]. Це також корелює зі зменшенням експресії і синтезу гена хрящової матриці in vitro [15, 16]. На думку деяких авторів, екзогенний глюкозамін протидіє дегенеративним ефектам, які IL-1β впливає на синтез протеоглікана [11, 15]. Також екзогенний глюкозамін знижує рівень утворення оксиду азоту, індукованого IL-1β і TNFα [16], і пригнічує синтез циклооксигенази-2 людськими хондроцитами у відповідь на дію IL-1β [17, 18].

Крім того, передбачається, що екзогенний глюкозамін активує синтез ГАГ, сприяючи продукуванню протеогліканів без обмеження перетворення глюкози в глюкозамін і, в кінцевому рахунку, в N-ацетил-D-глюкозамін (NАГ) глутаміном (фруктозо-6-фосфат амідотрансферази) [18]. Оскільки глюкоза і глюкозамін є іншими субстратами глюкокінази [19], фосфорілованний глюкозамін (глюкозамін-6-фосфат) пригнічує глюкокіназу і змінює наступний метаболізм як глюкози, так і глюкозаміну [20]. Miwa et al. повідомили, що глюкокіназа має низьку спорідненість до NАГ [21]. Тобто, NАГ кіназа опосередковує фосфорілувування NАГ для отримання NAG-6-фосфату, який не
впливає на активність глюкокінази [22-24]. Таким чином, NАГ-6-фосфат не впливає на активність глюкокінази, тим самим дозволяючи глюкозі і глюкозамінам залишатися незмінними в ході метаболізму. З цієї точки зору біосинтезу ГАГ сприятиме використання не глюкозаміну, а NАГ або деяких інших обмежуючих синтез аналогів глюкозаміну [16].

 

Рисунок 1. Глюкозаміновий біохімічний метаболічний шлях продукування субстратів, які беруть
участь у формуванні шкіри і хряща.

Обмеження, що стосуються пероральних препаратів

На перорально введений глюкозамін, його солі та NАГ діє пресистемний метаболізм в печінці [25]. Однак більш пізні повідомлення показують, що ці агенти можуть метаболізуватися головним чином в кишечнику, а не в печінці [26]. Накопичено мало фармакокінетичних даних про розподіл цих агентів в суглобовому хрящі. Setnikar et al. [27, 28] повідомили про фармакокінетичні властивості глюкозаміну у собак і людини. За їхніми оцінками, приблизно 87% початкової дози прийнятого перорально глюкозаміну поглинається і виводиться; <13% поширюється по всьому організму і тільки <1% досягає остеоартрітних суглобів. Аналогічні дані про біодоступності були недавно опубліковані Eddington et al. з Університету штату Меріленд, США [29], які підтвердили результати багатьох робіт Setnikar et al. З іншого боку, хондроїтин є метаболіт глюкозаміну, який, як відомо, деградує до основних дісахарідних компонентів в кишечнику, перш ніж буде включений в подальший метаболізм для отримання глюкозаміну [30]. Хоча лише невелика частина глюкозаміну досягає «мішені» – суглобового хряща (рис. 2), повідомляється, що він з часом проявляє деяку терапевтичну ефективність, від легкого до помірного [31].

Рисунок 2. Схема, що показує загальний фармакоканетичний шлях перорального глюкозаміну.

Потенціал застосування місцевих препаратів з трансдермальною доставкою

Потенціал застосування місцевих препаратів глюкозаміну з трансдермальною доставкою має переваги перед використанням традиційних пероральних лікарських форм. Ключовою перевагою є те, що стійке проникнення глюкозаміну через шкіру дозволить забезпечити більш стабільний рівень речовини в сироватці. Це часто є метою застосування ліків з трансдермальною доставкою. Внутрішньовенна інфузія більш інвазивна, хоча і є конкурентною альтернативою. Важливо, що трансдермальне введення дозволяє обійти пресистемний метаболізм в печінці – додаткове обмеження пероральної доставки глюкозаміну. Доставка глюкозаміну через шкіру дозволила б знизити шоковий вплив на організм за рахунок зменшення зміни пікових концентрацій в плазмі, підвищує ризик побічних ефектів. Відомо, що глюкозамін продукується ендогенно в організмі людини відповідно до метаболічного шляху, показаним на рисунку 1; очевидно, що для ефективної
роботи систем організму потрібно відносно стабільний рівень глюкозаміну в плазмі. У міру старіння і впливу чинників активного способу життя наші тіла перестають виробляти достатню кількість метаболітів глюкозаміну для підтримки здорового стану шкіри, хрящів і тканин. Тобто, необхідно вводити в організм екзогенний глюкозамін для поліпшення стану цих тканин. Нещодавно був опублікований огляд під назвою «Ефекти глюкозаміну в організмі людини: огляд впливу на метаболізм глюкози, побічні ефекти, міркування безпеки і ефективність» [32], в якому глюкозамін і його метаболіти охарактеризовані як безпечні і нетоксичні. Таким чином, глюкозамін і його метаболіти є перспективними речовинами для трансдермальної доставки.

Дослідження проникності шкіри для RevalifeTM

Для всіх досліджень проникності in vitro в якості моделі шкіри використовувалася модельна мембрана. Проведено численні експерименти по оптимізації складу RevalifeTM з використанням дифузійних осередків Франца. Рецепторні осередки заповнювали 0,1 M фосфатним буфером з рН 7,4 pH для імітації фізіологічного рН. Температуру рецепторного розчину підтримували на рівні 37°С і перемішували за допомогою магнітної мішалки. Мембрани встановлювали між рецепторними та донорними осередками. Поверхня, що піддавалася дифузії, становила 2,54 см2 (діаметр 1,8 см), а обсяг рецепторних осередків становив 6 см3 . Зверху донорні осередки покривали пластиковою плівкою. Систему врівноважували при 37°С протягом 2 годин до кожного експерименту.

Осередки-донори заповнювали 5 мл Revalife. Зразки (N=3) відбирали з інтервалами в 24-48 годин, брали 200 мкл зразків рецепторних розчинів і замінювали свіжим буфером; експерименти проводилися в трьох повторах. Кількість NАГ, який проник через «шкіру»,  визначалася за допомогою методу високоефективної аніонообмінної хроматографії з імпульсним амперометричним детектуванням (ВЕАХ-ИАД).

Глюкозамін, що здатний проникати через модельну мембрану, був проаналізований в Центрі по дослідженню комплексних вуглеводів Університету Джорджії, США. Була використана ВЕАХ-ИАД (Dionex, Саннівейл, Каліфорнія, США) в системі Dionex DX-500, що складається з градієнтного насоса P40, електрохімічного детектора ED40, Автосамплера AS3500 і робочої станції для хроматографії PeakNet. Апарат ВЕАХ-ИАД був оснащений аналітичної аніонообмінною колонкою CarboPac TM PA20 (3×150 мм) для швидкого поділу з високою роздільною здатністю моносахаридів і дисахаридів з використанням імпульсного амперометричного детектування, аналітичної захисної колонки CarboPac PA20 (3×30 Мм) і карбонатної предколонки (25×15 мм). У мобільній фазі (А) використовували дегазовану і деіонізовану воду. У рухомій фазі (Б) використовували 0,02 Н NaOH, приготований на деіонізірованій воді і пропущений через фільтри 0,45 мкм в апараті для фільтрації розчинника (Waters-Millipore, Мілфорд, Массачусетс, США), який дегазували під вакуумом. Мобільна фазова система працювала при градієнтної концентрації 16 мМ NaOH при швидкості потоку 0,5 мл / хв. Стандартна калібрувальна крива для NАГ (рис. 3.1 та 3.2) була отримана з лінійної регресією (R2 = 0,9936). Кожен набір зразків виконувався з використанням зовнішніх стандартів. Значення концентрації зразка були отримані за допомогою програмного забезпечення Peak Net. Ці значення порівнювалися з даними, отриманими при розрахунках площі піку і висоти піку, які спостерігаються як функції лінійного рівняння регресії стандартної кривої.

Стаціонарний стан потоку (Jss) для NАГ (мг/см2/ч) або (мкг/см2/ч) розраховувалася по збільшенню кількості глюкозаміну в рецепторному середовищі [34]. Коефіцієнт проникності NАГ (kp) в см/год розраховувався по відомим фізико-хімічним параметрам [35]. Експериментальні коефіцієнти проникності NАГ (Кр) в см/год визначалися розподілом Jss на кумулятивну концентрацію в донорних осередках. Час затримки (tlag) визначалося графічно за кумулятивним кількості глюкозаміну з RevalifeTM, що виділяється на одиницю площі (мг/см2) або (мкг/см2
) в залежності від часу (h). Для контролю швидкості вивільнення глюкозаміну in vitro (мг/см2) або (мкг/см2) визначали залежність квадратного кореня показника часу (t1/2) від кумулятивної кількості лікарського засобу, що вивільняється на одиницю площі (мг/см2) або (мкг/см2) . [36] Всі дані були представлені відповідно до галузевих протоколів керівництва Управління з контролю якості харчових продуктів і медичних препаратів США (FDA) [37].

Висновок

Застосування глюкозаміну дає надію пацієнтам з остеоартритом (ОА), оскільки в ряді розглянутих наукових досліджень було показано, що він полегшує симптоми болю і запалення, пов’язані з ОА. Найбільш важливим є те, що він охороняє суглоби від подальшого погіршення їх
стану. У кількох дослідженнях було показано, що глюкозамін не тільки сприяє поліпшенню стану суглобів, але також інвертує протікання ОА. Національні інститути здоров’я США (National Institutes of Health) в даний час проводять триваюче багатоцентрове дослідження, назване Glucosamine / Chondroitin Arthritis Intervention Trial (GAIT; дослідження застосування глюкозаміну / хондроїтину при артритах). Його результати планується отримати восени 2005 року. У ранніх звітах було вказано, що це дослідження в значній мірі підтвердить переваги ОА щодо глюкозаміну, описані в публікаціях про попередніх дослідженнях.

Однак ефективність глюкозаміну при лікуванні ОА значно обмежена доступними методами його введення в організм. В даний час глюкозамін продається у вигляді таблеток, капсул, порошків, напоїв, кремів і гелів. На жаль, лише менше 1% перорально введених доз досягають суглобів. Глюкозамін у складі сучасних кремів і гелів не проникає через шкіру. Отже, в той час як методи пероральної доставки можуть забезпечити достатню кількість глюкозаміну для деяких осіб з легкою формою ОА, вони не забезпечують достатньої кількості для страждаючих ОА з більш серйозними проблемами.

Дослідження in vitro продемонстрували, що молекула глюкозаміну в складі RevalifeTM, метаболіт глюкозаміну, володіє чудовою властивістю проникати через мембрани шляхом трансдермального транспорту та/або черезшкірного всмоктування.

Препарат III A показав найкращі швидкість вивільнення, стаціонарний стан потоку і коефіцієнт проникності, (табл. 1). Дані показують хороші результати проникності як для III A, так і для III Б. Однак швидкості вивільнення препаратів II Б і III Б є порівнянними. Для порівняння, Jss і коефіцієнт проникності NАГ значно вище для речовини-носія III A, ніж для III Б. Спрощене графічне порівняння
отриманих фізико-хімічних даних показано на рисунку 3.1 та 3.2. Виходячи з цих даних, розробили оптимальну лікарську форму RevalifeTM, показники для якої були можна порівняти з показниками для II Б, III Б і III A.

Площа «шкіри» в модельній системі набагато менше, ніж у середня площа шкіри людини, що покриває суглоб. Тому екстраполяція даних, отриманих для Revalife TM, дає набагато більший, ніж 15 мг, потенціал проникнення глюкозаміну в шкіру. Це стосується швидкості вивільнення речовини і величини Jss. Оптимальна форма, III A, дає швидкість стабільного вивільнення 10,3 мг/см2 / год. Кількість 15 мг еквівалентно 1%, що отримується при дозуванні 1500 мг пероральних препаратів глюкозаміну, прийнятих 4 рази на день. Проблема в тому, що набагато менше 1% при такій щоденній дозі досягає суглоба. Висновок полягає в тому, що для колінного суглоба використовується
буквально один грам препарату Revalife, що містить 100 мг молекули глюкозаміну. Протягом двох годин понад 99% ± проникнуть через шкіру. Таким чином, доставка речовини до суглобу, ураженого ОА, перевищить 15 мг, еквівалентних прийому в дозі 1500 мг 4 рази на день оральних препаратів глюкозаміну у вигляді порошків, таблеток, напоїв і т. д.

Таблиця 1. Фізико-хімічні дані, отримані для проникнення молекули глюкозаміну при
використанні Revalife™

++++

Рисунок 3.1. Фізико-хімічні дані, отримані для проникнення глюкозаміну в складі RevalifeTM з
різних оптимальних / неоптимальні носіїв. Кумулятивна концентрація (n=3) на одиницю
поверхні ± стандартне відхилення в залежності від квадратного кореня часу.
Рисунок 3.2. Графічне порівняння фізико-хімічних даних, отриманих для проникнення NАГ.

Література

1) Lewis, C. “Arthritis: Timely Treatments for an Ageless Disease.” U.S. Food and Drug Administration Consumer Magazine August 2000.
2) McCarty, M. F. “Enhanced synovial production of hyaluronic acid may explain rapid clinical responses to high-dose glucosamine in Osteoarthritis.” Medical Hypothesis (1998), 50, 507-510.
3) Hauselmann, H. J. “Nutripharmaceuticals for Osteoarthritis.” Best Practice and Research. (2001) 5(4), 598-607
4) Brief, A.. A., Maurer, M., Di Cesare, P. E.. “Use of Glucosamine and Chondroitin Sulfate in the management of Osteoarthritis.” Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 9(2 ) March/April 2001
5) Theodasakis, J., Fox, B., Adderly, B. The Arthritis Cure. 1st Edition. St. Martin’s Press. New York, NY. 1997
6) Montaudo, M. “Molar mass distributions by size exclusion chromatography.” Macromolecules. 31, 3839-3845.
7) Kelley, G. “The Role of Glucosamine Sulfate and Chondroitin Sulfate in the treatment of degenerative joint disease.” Alternative Medicine Review (1998) 3(1).
8) Lamari, F. N., Militsopoulou, M., Mitropoulou, T. N., Hjerpe, A., Karamanos, N. K. Analysis of glycosaminoglycan-derived disaccharides in biological samples by capillary electrophoresis and protocol for sequencing glycosaminoglycans. Biomed. Chromatogr. 2002 16, 95-102.
9) Towheed, T.E. and Anastassiades, T.P. Glucosamine and chondroitin for treating symptoms of osteoarthritis: evidence is widely touted but incomplete. J Am Med Assoc (2000) 283, 1483–1484.
10) Lopes, Vaz A. Double-blind clinical evaluation of the relative efficacy of ibuprofen and glucosamine sulphate in the management of osteoarthrosis of the knee in outpatients. Curr Med Res Opin (1982) 8, 145–149.
11) Muller-Fassbender, H., Bach G.L., Haase, W., Rovati, L.C., and Setnikar, I. Glucosamine sulfate compared to ibuprofen in osteoarthritis of the knee. Osteoarthritis Cartilage (1994) 2, 61–69.
12) Ruane, R. and Griffiths, P. Glucosamine therapy compared to ibuprofen for joint pain. Br J Community Nurs (2002) 7, 148–152.
13) Sandy J. D., Gamett, D., Thompson, V., and Verscharen, C. Chondrocyte-mediated catabolism of aggrecan: aggrecanase-dependent cleavage induced by interleukin-1 or retinoic acid can be inhibited by glucosamine. Biochem J (1998) 335, 59–66.
14) Sekiya, I., Tsuji, K,, Koopman, P., Watanabe, H., Yamada, Y., Shinomiya, K., Nifuji, A., and Noda, M. SOX9 enhances aggrecan gene promoter/enhancer activity and is up-regulated by retinoic acid in a cartilage-derived cell line, TC6. J Biol Chem (2000) 275, 10738–10744.
15) Goldring, M.B., Fukuo, K., Birkhead, J.R., Dudek, E., and Sandell, L.J. Transcriptional suppression by interleukin-1 and interferon- of type II collagen gene expression in human chondrocytes. J Cell Biochem (1994) 54, 85–99.
16) Seguin, C.A. and Bernier, S.M. TNF suppresses link protein and type II collagen expression in chondrocytes: role of MEK1/2 and NF-B signaling pathways. J Cell Physiol (2003) 197, 356–369.
17) Gouze, J.N.,, Bianchi, A., Becuwe, P., Dauca, M., Netter, P., Magdalou, J., Terlain B., and Bordji, K. Glucosamine modulates IL-1-induced activation of rat chondrocytes at a receptor level and by inhibiting the NF-B pathway. FEBS Lett. (2002)510, 166–170
18) Shikhman, A.R., Kuhn, K., Alaaeddine, N., and Lotz, M. N-Acetylglucosamine prevents IL-1-mediated activation of human chondrocytes. J Immunol (2001) 166, 5155–5160.

19) Largo R, Alvarez-Soria MA, Diez-Ortego I, Calvo E, Sanchez-Pernaute O, Egido J, and Herrero-Beaumont. Glucosamine inhibits IL-1-induced NFB activation in human osteoarthritic chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage (2003) 11, 290–298.
20) McClain, D.A. and Crook, E.D. Hexosamines and insulin resistance. Diabetes (1996) 45, 1003–1009.
21) Singh, L.P., Andy, J., Anyamale, V., Greene, K., Alexander, M., and Crook, E.D. Hexosamine-induced fibronectin protein synthesis in mesangial cells is associated with increases in cAMP responsive element binding (CREB) phosphorylation and nuclear CREB: the involvement of protein kinases A and C. Diabetes (2001) 50, 2355–2362.
22) Van Schaftigen, E. Glucosamine-sensitive and -insensitive detritiation of [2–3H]glucose in isolated rat hepatocytes: a study of the contributions of glucokinase and glucose-6-phosphatase. Biochem J (1995) 308, 23–29.
23) Virkamaki, A. and Yki-Jarvinen, H. Allosteric regulation of glycogen synthase and hexokinase by glucosamine-6-phosphate during glucosamine-induced insulin resistance in skeletal muscle and heart. Diabetes (1999) 48, 1101–1107.

24) Miwa, I., Mita, Y., Murata, T., Okuda, J., Sugiura, M., Hamada, Y., and Chiba, T. Utility of 3-O-methyl-N-acetyl-D-glucosamine, an N-acetylglucosamine kinase inhibitor, for accurate assay of glucokinase in pancreatic islets and liver. Enzyme Protein (1994) 48, 135–142.
25) Setnikar, I.; Giacchetti, C.; Zanolo, G. Pharmacokinetics of glucosamine in the dog and in man. Arzneimittel-Forschung 1986, 36(4), 729-35. Aghazadeh-Habashi, A.; Sattari, S.; Pasutto, F.; Jamali, F. Single dose pharmacokinetics and bioavailability of glucosamine in the rat. 2000 5(2), 181-184.
26) Setnikar, I.; Palumbo, R.; Canali, S.; Zanolo, G. Pharmacokinetics of glucosamine in man. Arzneimittel-Forschung 1993, 43(10), 1109-13.
27) Setnikar, I.; Giacchetti, C.; Zanolo, G. Pharmacokinetics of glucosamine in the dog and in man. Arzneimittel-Forschung 1986, 36(4), 729-35.
28) Setnikar I; Rovati L C Absorption, distribution, metabolism and excretion of glucosamine sulfate. A review. Arzneimittel-Forschung 2001, 51(9), 699-725.
29) Du, J., White, N., Eddington, N. D. The bioavailability and pharmacokinetics of glucosamine hydrochloride and chondroitin sulfate after oral and intravenous single dose administration in the horse. Biopharmaceutics & Drug Disposition 2004, 25(3), 109-116.
30) Lamari, F. N., Militsopoulou, M., Mitropoulou, T. N., Hjerpe, A., Karamanos, N. K. Analysis of glycosaminoglycan-derived disaccharides in biological samples by capillary electrophoresis and protocol for sequencing glycosaminoglycans. Biomed. Chromatogr. 2002 16, 95-102.
31) McAlindon;T . E., LaValley; M. P., Gulin; J. P. Felson, D. T. Glucosamine and Chondroitin for Treatment of Osteoarthritis: A Systematic Quality Assessment and Meta-analysis., JAMA. 2000, 283, 1469-1475.
32) J. W. Anderson, R.J. Nicolosi and J.F. Borzelleca, Glucosamine effects in humans: a review of effects on glucose metabolism, side effects, safety considerations and efficacy, Food and Chemical Toxicology, Volume 43, Issue 2, February 2005, Pages 187-201.
33) a) Garner, Jr., Solomon T., Israel, Bridg’ette J., Abney, Trina, Azadi, Parastoo, Capomacchia, Anthony C. Prelimunary Studies on the Transdermal Permeability of N-Acetyl-D-Glucosamine.(NAG): An Active Metabolite of Glucosamine. Unpublished b Garner, Jr., Solomon T., Israel, Bridg’ette J., Abney, Trina, Azadi, Parastoo, Capomacchia, Anthony C.. Permeation Studies of NAG from Pluronic-Organo-Gel Formulations. Unpublished
34) Lamari, F. N., Militsopoulou, M., Mitropoulou, T. N., Hjerpe, A., Karamanos, N. K. Analysis of glycosaminoglycan-derived disaccharides in biological samples by capillary electrophoresis and protocol for sequencing glycosaminoglycans. Biomed. Chromatogr. 2002 16, 95-102.
35) Towheed, T.E. and Anastassiades, T.P. Glucosamine and chondroitin for treating symptoms of osteoarthritis: evidence is widely touted but incomplete. J Am Med Assoc (2000) 283, 1483–1484.
36) Lopes, Vaz A. Double-blind clinical evaluation of the relative efficacy of ibuprofen and glucosamine sulphate in the management of osteoarthrosis of the knee in outpatients. Curr Med Res Opin (1982) 8, 145–149.
37) Guidance for Indusry: SUPAC-SS Semisolid Dosage Forms. Scale-up and Postapproval Changes: Chemistry, Manufacturing, and Control; In Vitro Release Testing and In Vivo Bioequivalence Documentation. US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration.

? Безкоштовна консультація